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| 产品名称 | 检测方法 | 规格 | 货号 |
| 酸性蛋白酶（Acid protease, ACP）试剂盒 | 分光光度法 | 50管/24样 | CS-01Ｓ63227 |
测定原理：
酸性条件下，ACP催化酪蛋白水解产生酪氨酸；在碱性条件下，酪氨酸还原磷钼酸化合物生成钨蓝；钨蓝在680nm有特征吸收峰，通过测定其吸光度增加，来计算ACP活性。
自备仪器和样品：
可见分光光度计、水浴锅、磁力搅拌器、可调式移液枪、1mL玻璃比色皿、1.5 mL EP管和蒸馏水。
试剂组成和配置：
液体一：1.5mL×1支，4℃保存。
液体二：1mL×1支，4℃保存。
试剂一的配制：临用前按液体一：液体二：蒸馏水=76（μL）：17（μL）：18（mL）的比例配制，现配现用，如出现白色絮状沉淀则不能用。
试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加10 mL蒸馏水溶解。
试剂三：粉剂×1瓶，4℃避光保存。临用前加入20 mL试剂一，沸水浴中磁力搅拌溶解。（可在烧杯上盖一层保鲜膜，注意观察，避免水分全部蒸发，一般加热15-30分钟，该试剂为过饱和试剂，充分混匀后仍出现颗粒物不溶物不影响使用）。
试剂四：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入50 mL蒸馏水溶解。
试剂五：液体10mL×1瓶，4℃保存。
标准品：液体1mL×1支，0.25 μ mol/mL标准酪氨酸溶液，4℃保存。
粗酶液提取：
1. 试剂一的配制：见试剂的组成和配制。
2. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）冰浴匀浆，8000g，4℃离心10min，取上清，即粗酶液。
3. 血清或培养液：直接测定。
4. 细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。
测定操作：
1.分光光度计预热30min，调节波长到680 nm，蒸馏水调零。
2.试剂二、试剂三和试剂四置于30℃水浴保温30min。
3. 对照管：取一支EP管，加入100μL粗酶液，200μL试剂二，混匀后置于30℃水浴保温10min；加入200μL试剂三，混匀后8000g， 4℃离心10min；取200μL上清液，加入新的EP管，再加入1000μL试剂四，200μL试剂五，混匀后置于30℃水浴保温20min，于680nm测定光吸收，记为A对照管。
4. 测定管：取一支EP管，加入100μL粗酶液，200μL试剂三，混匀后置于30℃水浴保温10min；加入200μL试剂二，混匀后8000g， 4℃离心10min；取200μL上清液，加入新的EP管，再加入1000μL试剂四，200μL试剂五，混匀后置于30℃水浴保温20min，于680nm测定光吸收，记为A测定管。（注意与空白管不同，先加试剂三，后加试剂二）
5. 空白管：取EP管，加入200μL蒸馏水，1000μL试剂四，200μL试剂五，混匀后置于30℃水浴保温20min，于680nm测定光吸收，记为A空白管。
6. 标准管：取EP管，加入200μL标准品，1000μL试剂四，200μL试剂五，混匀后置于30℃水浴保温20min，于680nm测定光吸收，记为A标准管。
注意：空白管和标准管只需要测定一次。
ACP活性计算公式：
1. 按照样本蛋白浓度计算
ACP活性单位定义：30℃每毫克蛋白每分钟水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。
ACP活性（nmol/min /mg prot）= C标准品×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）×V反总÷(Cpr×V1)÷T= 125×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）÷Cpr
2．按照样本质量计算
ACP活性单位定义：30℃每克样品每分钟催化水解产生1 nmol酪氨酸为1个酶活单位。
ACP活性（nmol/min /g鲜重）=C标准品×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）×V反总÷（W×V1÷V2）÷T= 125×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）÷W
3. 按照液体体积计算
ACP活性单位定义：30℃每毫升样品每分钟催化水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。
ACP活性（nmol/min/mL）=C标准品×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）×V反总÷V1÷T= 125×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）
1.按照细胞数量计算
ACP活性单位定义：30℃每104个细胞每分钟催化水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。
ACP活性（nmol/min /104 cell）=C标准品×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）×V反总÷（细胞数量×V1÷V2）÷T= 125×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白管）÷细胞数量
C标准品：0.25 μ mol/mL标准酪氨酸溶液；V反总：酶促反应总体积，0.5mL；Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/mL）；V1：加入反应体系中粗酶液体积（mL），0.1 mL；V2：提取液总体积（mL），1mL；T：催化反应时间（min），10min；W：样品质量（g）。
注意事项：
1.试剂一按操作指示配制，用多少配多少，出现白色絮状沉淀则不能用。
2.临用前配制的试剂配置好后3天内使用完毕。
原创作者：上海莼试生物技术有限公司
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