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本试剂盒提供了一种简单、快速、高效的从石蜡包埋组织中提取DNA的方法。实验过程中可采取无毒的去蜡剂去除石蜡，降低实验过程中对实验者的危害。组织裂解后，DNA结合于硅基包被磁珠表面。漂洗后，高纯度的DNA洗脱于EB或去离子水中。DNA的得率、片段大小与样品类型，及储存条件、时间有很大关系。提取得到的DNA可用于定量PCR、二代测序建库等下游检测。

保存条件：室温（15-30℃）。

自备试剂：无水乙醇、异丙醇

实验前准备及重要注意事项：

1．向25 mg Proteinase K粉末中加入1.25 ml Proteinase K Storage Buffer，涡旋震荡混匀使其充分溶解，之后-20℃保存备用。

2．第一次实验前按照试剂瓶标签上的说明向Buffer GW1和Buffer GW2中加入指定用量的无水乙醇。

3．Magbeads PN严禁冰冻和高速离心，否则可能会对Magbeads PN造成不可逆的损害。

操作方法：

石蜡去除（方案一二甲苯法）

1．用刀片去除组织周围多余石蜡，之后切取5-8片5-10μm的石蜡卷放入1.5 ml离心管中。

2．向离心管中加入1 ml二甲苯，涡旋震荡10秒使石蜡充分溶解。

3．16,000×g离心2分钟，之后吸弃溶液，小心沉淀丢失。

4．向离心管中加入1 ml无水乙醇，涡旋震荡10秒。

5．16,000×g离心2分钟，之后吸弃溶液，小心沉淀丢失。
6．打开管盖，室温放置10分钟使乙醇充分挥发。

实验步骤：

(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可！固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀

(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次

(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)

(7)10,000rpm,4℃离心20min

(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃离心20 min

(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC处理水溶解

(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量

(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)

操作步骤:

1. 匀浆处理:a.组织将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。

b.单层培养细胞直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。

c．细胞悬液离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。产品仅用于科研

2．将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。

3．可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。

6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。

7. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。

8. 2-8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

原创作者：上海莼试生物技术有限公司

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