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酶免疫技术——酶和酶作用的底物
阅读：580 发布时间：2019/9/18 16:16:58
酶免疫技术是利用酶催化底物反应的生物放大作用，提高特异性抗原-抗体免疫学反应检测敏感性的一种标记免疫技术。该技术所用的酶要求纯度高、催化反应的转化率高、专一性强、性质稳定、来源丰富、价格不贵、制备成的酶标抗体或抗原性质稳定，继续保留着它的活性部分和催化能力。zui好在受检标本中不存在与标记酶相同的酶。另外它的相应底物应易于制备和保存，价格低廉，有色产物易于测定，光吸收高。
酶和酶作用的底物
1.辣根过氧化酶（HRP）：HRP在蔬菜作物辣根中含量很高，纯化方法也不复杂。它是一种糖蛋白，含糖量约18%；分子量为44kD；是一种复合酶，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结合而成的一种卟啉蛋白质。主酶为无色糖蛋白，在275nm波长处有zui高吸收峰；辅基是深棕色的含铁卟啉环，在403nm波长处有zui高吸收峰。HRP对受氢体的专一性很高，除H202外，仅作用于小分子醇的过氧化物和尿素的过氧化物。后者为固体，作为试剂较H202方便。
许多化合物可作为HRP的供氧体，在ELISA中常用的供氢体底物为邻苯二胺（OPD）、四甲基联苯胺（TMB）和ABTS.OPD为在ELISA中应用zui多的底物，灵敏度高，比色方便。其缺点是配成应用液后稳定性差，而且具有致异变性。TMB无此缺点。TMB经酶作用后由无色变蓝色，目测对比鲜明；加酸停止酶反应后变黄色，可在比色计中定量；因此应用日见增多。ABTS，虽然灵敏度不如0PD和TMB，但空白值很低。
2.碱性磷酸酶（AP）：是从牛肠粘膜或大肠杆菌中提取。从大肠杆菌提取的AP分子量为80kD，酶作用的zui适pH为8.0；用小牛肠黏膜提取的AP分子量为l00kD，zui适pH为9.6.一般采用对**苯***（p-NPP）作为底物。它可制成片状试剂，使用方便。产物为黄色的对**酚，在405nm有吸收峰。用NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一段时间。
在ELISA中应用AP系统，其敏感性一般高于应用HRP系统，空白值也较低。但由于AP较难得到高纯度制剂，稳定性较HRP低，价格较HRP高，制备酶结合物时得率较HRP低等原因，国内在ELISA中一般均采用HRP.3.其他的酶：有葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和脲酶等。β-半乳糖苷酸的底物常用4-甲基伞基-β-半乳糖苷，经酶水解后产生荧光物质4-甲基伞酮，可用荧光计检测。荧光的放大作用大大提高了方法的敏感度。AP也可应用可产生荧光的伞基***作底物。其缺点是需要荧光计测定，而且如用固相载体直接作为测定容器，此载体不可发出荧光。脲酶的特点是酶作用后反应液发生pH改变，可使指示剂变色；另外，在人体内没有内源酶。
原创作者：上海莼试生物技术有限公司
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![人胚肾细胞；293 [HEK-293]](http://img5.zhihuilv.com/223/Products/Small/20190314/201903141023106619.jpg)
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