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蛋白样品制备,一般裂解液包含几个组分
阅读：3447 发布时间：2019/5/14 9:36:21
Western Blot 又称为蛋白质印迹，是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的基于抗原抗体之间特异免疫反应的一种定量或定性检测蛋白的实验方法。
其基本原理为：聚丙烯酰胺凝胶电泳将不同分子量的蛋白质样品分离，分离后的蛋白被转移到固相支撑物（杂交膜）上，一抗特异性识别目标蛋白，通过HRP、AP、生物素、地高辛或者荧光探针等标记的二抗识别一抗，最终通过显色、荧光或者化学发光等方法将目标蛋白可视化，从而对目标蛋白进行定性和定量分析。
良好的开始是成功的一半，充分裂解并保存良好的优质的蛋白样品对 Western Blot 实验至关重要。下面我们将从蛋白样品制备的方法和试剂选择上给大家一些建议。
裂解液的选择
蛋白样品制备，首先要选择合适的裂解液。一般裂解液包含以下几个组分:
1. 缓冲系统：裂解液pH过高或过低都可能使蛋白质变性析出或水解，因此通常采用近似生理pH的buffer来作缓冲体系。Tris-HCl缓冲液因其缓冲能力强，不容易与其它离子形成不溶物，且与整个电泳系统兼容性好，因此是裂解的首选缓冲液。
2. 盐离子浓度：通常大家习惯以生理盐浓度作为裂解液的盐离子浓度。在提胞浆蛋白等易溶组分时，也有通过低盐而实现低渗，从而使细胞胀破以实现质膜分离的，这种情况下一般使用不超过50mM的NaCl。当盐离子浓度过高时，部分蛋白可能会因盐析而出现沉淀， 此外过高的离子浓度会导致泳道内局部电流过大，容易跑出笑脸状条带。实际过程中即使有少数蛋白可能需要高盐提取的，也会借助透析等方法除去可能产生干扰的盐分，最终NaCl浓度一般不能高于500mM。
3. 变性剂：常用的变性剂有两类，一类是以尿素或硫脲为代表的变性剂，另一类则是各种表面活性剂（俗称去垢剂）。变性剂的作用主要是为了使蛋白变性溶解，在膜蛋白和包涵体蛋白提取时经常会加入尿素助溶。
4. 蛋白酶、去修饰酶抑制剂：组织或细胞内通常含有大量的蛋白酶和去修饰酶，由于细胞在裂解过程中会释放出多种内源性的蛋白酶、磷酸酶、去乙酰化酶等，容易导致目标蛋白降解或去修饰，从而影响后续的蛋白检测。所以在裂解时还需加入一些酶抑制剂。
常见的蛋白酶抑制剂有：PMSF、Aprotinin、Leupeptin、 Pepstatin，AEBSF-HCl等，其中PMSF对多种不同活性中心的蛋白酶都有极好的抑制作用而且效率高，因此基本是必加的试剂。
另外，做磷酸化蛋白的Western blot时，还需要加入磷酸酶抑制剂，避免磷酸化形式的蛋白发生去磷酸化。类似地，检测乙酰化蛋白的时候还需要加入去乙酰化酶抑制剂。
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