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产品名称 | 检测方法 | 规格 | 货号 |
细胞色素b5(Cytochrome b5)含量测定试剂盒 | 微量法 | 100T/96S | CS-01S63563 |
细胞色素P450酶是一组主要存在于肝脏的同工酶,在外源物质代谢中具有重要作用,尤其是药物和毒物的代谢。细胞色素P450和细胞色素b5是P450酶系的两个血红素蛋白,其比值的变化与P450代谢活性密切相关。
测定原理:
氧化型细胞色素b5经连二亚硫酸钠还原后,在424nm处有最大吸收峰,通过测定424nm和490nm处吸光值的差异,即可计算出细胞色素b5的含量。
自备仪器和用品:
普通离心机,超速离心机、可调式移液枪、紫外分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、和蒸馏水。
试剂组成和配制:
试剂一:粉剂×2瓶,4℃保存。临用前各加100mL蒸馏水,充分溶解。
试剂二:液体×1瓶,4℃保存。
试剂三:粉剂×1瓶,4℃保存。
工作液配制:临用前配制,戴一次性手套,小心打开试剂三瓶盖,加试剂二20mL充分溶解,4℃避光可保存1周。
样品中细胞色素b5提取:
1、除去细胞核,线粒体等大分子物质:称约0.5g组织,加入1mL试剂一,冰上充分研磨,10 000g 4℃离心30min,取上清液,转入超速离心管中。
2、粗制微粒体:100 000g,4℃离心60min,弃上清液。
3、除血红蛋白等杂质:向步骤2的沉淀中加1mL试剂一,盖紧后充分震荡溶解,100 000g离心30min,弃上清液。
4、待测液:向步骤3的沉淀中加试剂二0.5mL,盖紧后充分震荡溶解,即待测液,该待测液需当天测定。
细胞色素b5含量测定操作:
1. 分光光度计/酶标仪预热30 min。
2. 工作液置于25℃水浴中预热30 min。
3. 空白管:取1mL玻璃比色皿,加入10 μL蒸馏水,200μL工作液,室温静置2 min,424nm和490nm处吸光值,424nm处吸光值记为A空白管1,490nm处吸光值记为A空白管2。△A空白管= A空白管1- A空白管2
4. 测定管:取1mL玻璃比色皿,加入10 μL待测液,200μL工作液,室温静置2 min,424nm和490nm处吸光值,424nm处吸光值记为A测定管1,490nm处吸光值记为A测定管2。
△A测定管= A测定管1- A测定管2。
注意:只需要做一个空白管。
样品细胞色素b5含量计算公式:
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
(1)按蛋白浓度计算
细胞色素b5含量(nmol/mg prot) = (△A测定管-△A空白管)÷(ε×d)×V反总÷(Cpr×V样)
= 122.8×(△A测定管-△A空白管)÷Cpr
(2)按样本质量计算
细胞色素b5含量(nmol/g 鲜重)= (△A测定管-△A空白管)÷(ε×d)×V反总×(V样总÷V样)÷W
= 61.4×(△A测定管-△A空白管)÷W
ε:还原型细胞色素b5纳摩尔消光系数,171×10-6 L/nmol/cm;d:比色皿光径(cm),1cm; V反总:反应体系总体积,210 μL =2.1×10-4 L;Cpr:待测液蛋白质浓度(mg/mL),需要另外测定;V样:加入反应体系中待测液体积,10 μL=0.01 mL;V样总:待测液总体积,0.5 mL;W:样品质量(g)。
b.使用96孔板测定的计算公式如下
(1)按蛋白浓度计算
细胞色素b5含量(nmol/mg prot) = (△A测定管-△A空白管)÷(ε×d)×V反总÷(Cpr×V样)
= 245.6×(△A测定管-△A空白管)÷Cpr
(2)按样本质量计算
细胞色素b5含量(nmol/g 鲜重)= (△A测定管-△A空白管)÷(ε×d)×V反总×(V样总÷V样)÷W
= 122.8×(△A测定管-△A空白管)÷W
ε:还原型细胞色素b5纳摩尔消光系数,171×10-6 L/nmol/cm;d:96孔板光径(cm),0.5cm; V反总:反应体系总体积,210 μL =2.1×10-4 L;Cpr:待测液蛋白质浓度(mg/mL),需要另外测定;V样:加入反应体系中待测液体积,10 μL=0.01 mL;V样总:待测液总体积,0.5 mL;W:样品质量(g)。
原创作者:上海莼试生物技术有限公司
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