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1. 开启电脑、检测器和泵，安装上色谱柱，打开软件，在方法组中设置进样量10 μL，梯度洗脱为0~5min，85%A+15%B; 5~10min，85%A+15%B; 10~30min，80%A+20%B; 30~30.1min， 60%A+40%B; 30.1~40min，0%A+100%B。流速1mL/min，柱温30℃，走样时间为50min，检测波长530nm，设置完毕保存方法组。

2.初始设置流动相A=85%，流动相B=15%，流速1 mL/min，待基线稳定后开始加样。

3.加入标准品10 μL，在50min内可分离C3G，C3G的保留时间在25min左右，（柱子不同，保留时间有差异），计算不同浓度的C3G标准品的峰面积。

4. 加入样品10 μL，在相应保留时间处检测C3G的峰面积。

酶活计算：

1.以标准品浓度（μmol/mL）为横坐标，峰面积为纵坐标计算C3G标准曲线。将样品峰面积代入标准曲线，计算样品C3G含量。

2.酶活单位定义：

A．每毫克组织蛋白每分钟催化反应产生1μmolC3G定义为一个酶活单位。

UFGT活性（μmol/min/mg prot）= C×V反总÷（V样×Cpr）÷ T

=0.117×C÷Cpr

B．每克组织每分钟催化反应产生1μmolC3G定义为一个酶活单位。

UFGT活性（μmol/min/g 鲜重）= C×V反总÷（V样×W÷V样总）÷ T

=0.117×C÷W

C：C3G浓度，μmol/mL ；V反总：反应总体积，0.35mL；V样：加入样本量，0.1mL，V样总：加入提取液体积，1mL，Cpr：蛋白含量，mg/mL；W：样本质量，g，T：反应时间，min

注意事项：

1、流速由小到大调节，避免柱压过大。

2、使用完毕时，先用50%的甲醇水溶液洗色谱柱45min，再用纯甲醇冲洗色谱柱30min。

3、标准品的稀释倍数要根据样品中C3G浓度确定，样品中C3G的峰面积必须落在不同浓度的C3G标准品的峰面积之内，该标准品稀释倍数只是一个参考。

注意：

1. 本产品仅供科研使用。请勿用于医药、临床诊断或治疗，食品及化妆品等用途。请勿存放于普通住宅区。
2. 为了您的安全和健康，请穿好实验服并佩戴一次性手套和口罩操作。

原创作者：上海莼试生物技术有限公司

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