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本产品是一种使用了高保真、扩增速度可以达到15秒/kb的BalbFusion DNA Polymerase的高保真PCR扩增用的2×预混液。本产品中含有2×BalbFusion DNA Polymerase，2×BalbFusion Buffer (with Mg2+)，2×dNTPs，只需加入适量引物、模板和水即可进行高保真PCR扩增。大大简化了PCR操作，使操作更加快捷，也减少了PCR操作过程中可能导致的污染，使PCR的重复性更好。

利用2×BalbFusion PCR MasterMix可以进行各种常规的PCR扩增，特别适合用于高保真和快速的定性和半定量的PCR扩增，以及长片段DNA(长度长可以过12kb的)的基因扩增和克隆。

扩增速度极快，扩增小于6kb的DNA片段时，延伸1kb只需要15秒。普通的DNA聚合酶延伸1kb通常需要1～2分钟。BalbFusion DNA polymerase由于其快的扩增速度，可以显著缩短PCR扩增所需的时间。

BalbFusion DNA Polymerase是一种高保真DNA聚合酶，不仅可以非常高效地催化5’至3’方向的依赖于DNA模板的脱氧核苷酸的聚合反应，它同时还具有3’至5’的外切酶活性(proofreading activity)，它的错误发生概率比Taq酶要低52倍，比pfu酶要约低6倍。

BalbFusion DNA Polymerase的扩增长度长，可以达到12kb。BalbFusion DNA Polymerase非常适合长片段DNA的扩增，扩增出来的片段可以轻松达到12kb，更长片段的扩增效果未经测试。BalbFusion DNA聚合酶可以轻松胜任具有复杂二级结构的、非常长的DNA片段的准确扩增，因此它是目的基因扩增和克隆的理想选择。

保存：-20℃，至少一年有效。适当避免反复冻融。如需频繁使用，可取适量存放于4℃，至少3天内有效。

注意事项：

由于PCR反应非常灵敏可以扩增目的基因序列过1000万倍，在使用BalbFusion酶时请注意避免微量待扩增DNA的污染，并尽量考虑设置不加模板的空白对照以确认是否有待扩增DNA的污染。

尽管本产品经过15次反复冻融后仍具有和冻融前几乎相同的PCR扩增效果，但仍宜适当避免反复冻融本产品，多次反复冻融可能使产品性能下降。

使用本产品前，一定要完全融化，并上下颠倒轻轻混匀后才能使用，尽量避免起泡。

实验步骤：

(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可！固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀

(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次

(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)

(7)10,000rpm,4℃离心20min

(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃离心20 min

(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC处理水溶解

(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量

(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)

操作步骤:

1. 匀浆处理:a.组织将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。

b.单层培养细胞直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。

c．细胞悬液离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。产品仅用于科研

2．将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。

3．可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。

6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。

7. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。

8. 2-8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

原创作者：上海莼试生物技术有限公司

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