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产品名称	英文名称	规格	货号
长片段DNA快速高保真PCR MasterMix(含红色示踪染料)	Fast&HiFi Long DNA PCR MasterMix	1ml\|5ml	CS-01F99172

本产品包含高速高保真长片段DNA聚合酶、dNTPs和优化的反应缓冲液，浓度为2×。使用时只需加入模板、引物，并补足水至Mix终浓度为1×即可。所含DNA聚合酶为多种采用最先进基因工程改造而来的超保真酶添加延伸因子混合而成，极大的提高了扩增长度、扩增速度、保真性和产量。本品是长片段超保真快速扩增的首选产品。本制品含红色示踪染料，不需添加上样缓冲液即可直接上样进行电泳；也可经过纯化处理，以用于酶切、连接、荧光测序等后续操作。

产品特点：

1. 扩增速度快：延伸速度可以达到3～4kb/min，是pfu的6～8倍。

2. 扩增产量高：一般PCR产物量比传统pfu产量高50%-100%。

3. 优异保真性：保真度是taq的54倍以上。一般随机挑一个菌测序便是正确无突变落。

4. 扩增长度长：以复杂基因组DNA为模板适合扩增不超过10kb左右的产物，以简单基因组、质粒和噬菌体DNA为模板适合扩增不超过15kb左右的产物。

注意事项

1. 本系统扩增速度快，质粒和简单基因组等简单模板可以采用10～15秒/kb，复杂模板如人类基因组可以采用20～25秒/kb。

2. 如果电泳发现主带上下拖尾模糊现象，或者泳道出现从上样孔拖下来的涂抹带现象，一般提示延伸时间过长，梯度缩短延伸时间（建议10～15秒/kb为梯度减少延伸时间）直到获得满意结果。

3. 对于GC含量很高的模板，预变性和变性温度可以提高到98℃。本聚合酶耐热性强，98℃对本聚合酶的活性无改变。

4. 如果扩增模板GC含量高或者模板复杂扩增效果不佳时，可在反应混合物中加入DMSO到终浓度1%～8%，按照1%梯度增加摸索最佳浓度。或者加入甜菜碱至终浓度1～1.7 M。并采用降落PCR（Touchdown PCR）。

储存条件：-20℃，有效期2年。
本制品别名：2×PCR MasterMix|长片段PCR MasterMix|高保真PCR MasterMix

实验步骤：

(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可！固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀

(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次

(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)

(7)10,000rpm,4℃离心20min

(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃离心20 min

(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC处理水溶解

(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量

(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)

操作步骤:

1. 匀浆处理:a.组织将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。

b.单层培养细胞直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。

c．细胞悬液离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。产品仅用于科研

2．将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。

3．可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。

6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。

7. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。

8. 2-8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

原创作者：上海莼试生物技术有限公司

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