一、实验前准备
试剂平衡：试剂盒从2-8℃环境取出后，室温放置15-20分钟，使所有组分恢复至室温，避免低温影响后续酶促反应活性。
洗涤液配制：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水按1:19比例稀释，若浓缩液出现结晶，可37℃水浴溶解后再稀释使用。
样本预处理：血清/血浆样本采集后自然凝固，2000-3000转/分离心20分钟取上清，若保存过程中出现沉淀需再次离心；细胞上清、组织匀浆样本同样经离心去除杂质后待测，避免溶血样本直接检测。
标准品复溶：使用
ELISA试剂盒配套的标准品稀释液复溶标准品，室温静置10分钟充分溶解后，梯度稀释成系列浓度，避免反复冻融。
二、标准操作步骤
设空白孔、标准品孔、待测样本孔，标准品孔各加不同浓度标准品50μL，样本孔加10μL待测样本+40μL样本稀释液，空白孔不加试剂。
除空白孔外，每孔加入100μL酶标抗体工作液，封板膜密封后37℃温育60分钟。
弃去孔内液体拍干，每孔加满洗涤液浸泡30秒后吸出，重复洗板5-6次，*后在吸水纸上充分拍干残留液体。
每孔加入底物工作液100μL，室温避光温育15分钟。
每孔加入100μL终止液，轻晃5秒混匀。
15分钟内用酶标仪在450nm波长下测定各孔吸光度（OD值），通过标准曲线计算样本中Eotaxin2的实际浓度。
三、关键操作注意事项
正式实验时待测样本建议做一式二份，同步设置阳性、阴性对照，保证结果准确性。
不同批次、不同
ELISA试剂盒的试剂严禁混用，避免交叉污染导致非特异性结合升高。
移液器需定期校准，更换不同试剂时必须更换全新吸头，防止孔间交叉污染。
若样本中待测物浓度过高，出现钩状效应导致结果偏低，可将样本按比例稀释后重新检测。
四、常见故障快速排查
显色弱/无信号：检查
ELISA试剂盒是否过期、孵育时长是否不足、酶标仪波长是否设置为450nm。
背景过高：确认洗板次数是否达标、TMB底物是否被污染、孵育时间是否过长。
复孔偏差大：检查加样量是否准确、样本是否充分混匀、酶标板是否存在边缘温度不均的边缘效应。
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