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产品属性：

产品名称	英文名称	规格	货号
RNA样品高效保存液	RNA sample efficient preservation solution	100ml	CS-01F96419

本试剂是一种无毒的可直接使用的样品储存液，能使细胞内的RNA与RNA酶分离，可以快速可靠地保存动物组织、细胞内的RNA。组织获取后立即浸入保存液中，在室温可以保存7天，4℃可以保存4周，-20℃、-80℃标本可以长期保存，RNA稳定存在不降解，取出后用各类方法抽提可以获得高质量的RNA。。

操作步骤：

1、根据要保存的各样本的体积，计算出所需保存液用量。保存液的用量应当是组织体积的10倍(100mg组织约用1ml保存液)；离心收集2×107细胞保存液的用量是1ml。加入保存液的原则是：量宁多勿少。

建议在实际操作中不要称量组织，而直接根据目测结果加入保存液量，以加快操作和减少污染。例如5mm边长的立方体组织块，体积为125mm3=125μl，故应当加入1.25ml的保存液液。

2、将保存液按需要量分装入自备保存管中；

3、快速将较大的组织切成厚度<0.5 cm的任意片状，较小的组织直接取下，立即完全浸入保存液中。

注：组织的厚度一定要<0.5 cm。组织过厚则保存液不能有效渗入，组织中间部位的RNA不能受到保护。较大的组织可以切成厚度<0.5 cm的任意片状后保存，较小的组织(如大鼠的肾脏、脾脏，小鼠的大部分器官)则可以直接浸入保存液。

4、保存时先将样本浸入保存液后置4℃冰箱过夜(注：4℃过夜是必需的，这样可使保存液完全渗入到组织中)，然后转移到-20℃冰箱(保存液在-20℃时可能为液态，也可能为固态，如有结晶析出，也是正常情况)；或者在4℃冰箱过夜后，直接转移到-80℃冰箱。在保存液中保存的标本，反复冻融至室温20次不影响RNA的质量。

注意事项：

1、组织和细胞取材速度要快，在获取后应当尽快浸入保存液，以防止RNA降解。

2、冰冻组织不能用保存液保存，因为保存液不能有效渗入冰冻组织。

3、保存样品的RNA提取：样本从-20℃或-80℃冰箱取出后，复温到室温后，取出组织块，再用于提取RNA。细胞样本则复温后低速离心收集细胞，去除保存液，再用于提取RNA。后继的处理(如组织匀浆)可以在室温下进行，不必在液氮中操作，RNA仍能有效得到保护。残留少量保存液保存液不影响后继提取RNA的质量。

4、保存液在动物组织(如大鼠，脾脏)和细胞(如DH5α)RNA的保护中效果不错；植物材料种类繁多，没能一一测试(烟草和拟南芥叶片中的RNA能被保存液有效保护)，建议预实验后再使用。

储存条件：15～25℃，有效期24个月。

实验步骤：

(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可！固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀

(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次

(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)

(7)10,000rpm,4℃离心20min

(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃离心20 min

(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC处理水溶解

(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量

(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)

操作步骤:

1. 匀浆处理:a.组织将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。

b.单层培养细胞直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。

c．细胞悬液离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。

2．将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。

3．可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。

6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。

7. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。

8. 2-8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

原创作者：上海莼试生物技术有限公司

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