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产品名称 | 检测方法 | 规格 | 货号 |
磷脂酶C(?Phospholipases?C,PLC?)试剂盒 | 微量法 | 100T/96S | CS-01S63839 |
注意:正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
磷脂酶C(EC
测定原理
磷脂酶C催化水解NPPC产生对硝基苯酚,在410nm处有特征吸收峰。
自备实验用品及仪器
天平、研钵、超速冷冻离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、恒温水浴锅。
试剂组成和配制
提取液:液体100mL×1瓶,4℃保存。
试剂一:液体102mL×1瓶,4℃保存。
试剂二:液体10mL×1瓶,4℃避光保存。
试剂三:液体8mL×1瓶,4℃保存。
酶液提取
1.组织:按照质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g,加入1mL提取液)加入提取液,冰浴匀浆后于4℃,10000g离心5min,取全部上清于4℃、100000g离心30min,弃上清,取沉淀溶于1mL试剂一。
2.细胞:按照细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后于4℃,10000g离心5min,取全部上清于4℃、100000g离心30min,弃上清,取沉淀溶于1mL试剂一。
3.血清:直接测定。
测定操作
酶活计算公式
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
标准曲线:y = 0.0191x - 0.0103,R2 = 0.9991
1.按照蛋白浓度计算
酶活性定义:每毫克蛋白每分钟水解NPPC产生1nmol对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。
PLC活性(nmol/min/mg prot)=(△A+0.0103)÷ 0.0191×V反总÷(V样×Cpr) ÷T
= 17.45×(△A+0.0103)÷ Cpr
2.按照样本质量计算
酶活性定义:每克组织每分钟水解NPPC产生1nmol对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。
PLC活性(nmol/min/g 鲜重)=(△A+0.0103)÷ 0.0191×V反总÷(V样÷V样总×W) ÷T
= 17.45×(△A+0.0103)÷ W
3.按照细胞数量计算
酶活性定义:每104个细胞每分钟水解NPPC产生1nmol对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。
PLC活性(nmol/min/104 cell)=(△A+0.0103)÷ 0.0191×V反总÷(V样÷V样总×细胞数量) ÷T
= 17.45×(△A+0.0103)÷ 细胞数量
4.按照液体体积计算
酶活性定义:每毫升血清每分钟水解NPPC产生1nmol对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。
PLC活性(nmol/min/mL)= (△A+0.0103)÷ 0.0191×V反总÷V样÷T
= 17.45×(△A+0.0103)
V反总:反应总体积,0.2mL;V样:加入样本体积,0.02mL;V样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;W:样本质量,g;T:反应时间,30min
b.用96孔板测定的计算公式如下
标准曲线:y = 0.0095x - 0.0103,R2 = 0.9991
1.按照蛋白浓度计算
酶活性定义:每毫克蛋白每分钟水解NPPC产生1nmol对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。
PLC活性(nmol/min/mg prot)=(△A+0.0103)÷ 0.0095×V反总÷(V样×Cpr) ÷T
= 35.09×(△A+0.0103)÷ Cpr
2.按照样本质量计算
酶活性定义:每克组织每分钟水解NPPC产生1nmol对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。
PLC活性(nmol/min/g 鲜重)=(△A+0.0103)÷ 0.0095×V反总÷(V样÷V样总×W) ÷T
= 35.09×(△A+0.0103)÷ W
3.按照细胞数量计算
酶活性定义:每104个细胞每分钟水解NPPC产生1nmol对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。
PLC活性(nmol/min/104 cell)=(△A+0.0103)÷ 0.0095×V反总÷(V样÷V样总×细胞数量) ÷T
=35.09×(△A+0.0103)÷ 细胞数量
4.按照液体体积计算
酶活性定义:每毫升血清每分钟水解NPPC产生1nmol对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。
PLC活性(nmol/min/mL)= (△A+0.0103)÷ 0.0095×V反总÷V样÷T
= 35.09×(△A+0.0103)
V反总:反应总体积,0.2mL;V样:加入样本体积,0.02mL;V样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;W:样本质量,g;T:反应时间,30min
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原创作者:上海莼试生物技术有限公司
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