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TEV Protease是一种在大抽杆菌中重组表达的带His标签(6X His tag)的烟草蚀纹病毒(Tobacco Etch Virus,TEV)的半胱蛋白酶，能特异性地识别七肽序列Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly/Ser，并在Gln和Gly/Ser氨基酸残基之间进行酶切，常用于去除融合蛋白的Glutathione S-transferase(GST)、His或者其它标签的蛋白酶。

建议把GST或His等标签设计在融合蛋白的N端，并在GST或His等标签与目的蛋白之间设计加入TEV Protease专一性识别与酶切的上述七肽序列。这样在GST或His标签被酶切后，在目的蛋白的N端仅有一个额外的Gly/Ser氨基酸残基，从而大限度地减少了对目的蛋白结构和功能的影响。构建含有TEV Protease专一性识别位点的目的蛋白表达质粒，可以考虑选购的质粒pET-N-His-TEV(YT976)。

TEV Protease的佳酶切温度是30℃，在29～34℃范围内均具有较高的酶活性，但当温度达到或高于高37℃时，其酶活性会急剧下降。在实际操作过程中，为尽量保留目的蛋白的结构和生物活性，建议在4℃用TEV Protease酶切过夜。TEV Protease在pH6.0～9.0范围内具有活性，而当pH小于或等于5时，会失去酶活性。

TEV Protease还有一个突出的优点是在400mM咪唑中仍有较高活力，因此对于很多用鎳柱纯化的His标签目的蛋白，可直接将TEV Protease加入含高浓度咪唑的刚刚纯化的目的蛋白溶液中，在4℃边透析去除咪唑边进行酶切。当然也可以在透析后再用TEV Protease进行酶切以去除His标签。经过酶切的目的蛋白，溶液中带有His标签的本TEV Protease以及切除下来的His标签，都可以通过与镍柱结合而去除。His标签蛋白的纯化可以考虑选购我司的His标签蛋白纯化树脂或His标签蛋白纯化试剂盒，以及His标签纯化树脂(变性剂耐受型，货号：YTB4204)或His标签蛋白纯化试剂盒(变性剂耐受型，货号：YTB046)。
TEV Protease的酶活性不会被常见的丝蛋白酶抑制剂(serine protease inhibitor)如PMSF、AEBSF、bestatin、pepstatin、E-64、TLCK和EDTA所抑制。但靶向半胱(Cysteine)残基的蛋白酶抑制剂如NEM或IAA等，可以显著抑制TEV Protease的酶活力，因为天然的TEV Protease含有其维持酶活力所必需的Cys151。

实验步骤：

(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可！固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀

(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次

(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)

(7)10,000rpm,4℃离心20min

(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃离心20 min

(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC处理水溶解

(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量

(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)

操作步骤:

1. 匀浆处理:a.组织将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。

b.单层培养细胞直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。

c．细胞悬液离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。产品仅用于科研

2．将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。

3．可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。

6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。

7. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。

8. 2-8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

原创作者：上海莼试生物技术有限公司

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