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本品特别适用于从血清、血浆中分离纯化包括microRNA和其他小RNA(<200nt)在内的总RNA。本品灵活处理不同起始量的样品，在有效裂解样本的同时，可有效保存RNA的完整性，提取的总RNA完整性好，无蛋白和DNA污染，提取的RNA可用于RT-PCR、Northern Blot和分子克隆等下游实验。

自备试剂：氯仿、异丙醇、75%乙醇、无RNase的水(新开封或提取RNA专用)。

实验前准备及重要注意事项：

1、预防RNase污染，应注意以下几方面：

① 使用无RNase的塑料制品和枪头，避免交叉污染。

② 玻璃器皿应在使用前于180℃高温下干烤4小时，塑料器皿可在0.5 M NaOH中浸泡10分钟，用水彻底冲洗后高压灭菌。

③ 配制溶液应使用无RNase的水。

④ 操作人员戴一次性口罩和手套，实验过程中要勤换手套。

2、提取的样品避免反复冻融，否则影响RNA提取得率和质量。

3、本品中含有，具有毒性和腐蚀性。如果吸入体内、接触皮肤、吞食等会导致中毒、灼伤以及其他身体伤害。使用本制品时应穿戴防护物品，如装、手套、眼罩、面罩等。如果不小心接触到眼睛，应立即用大量的水冲洗并前往医院治疗。

4、样品用游离RNA(血清血浆尿液)提取试剂匀浆后，如不即刻加入氯仿，置于-70℃可放置一个月以上。

5、保存在75%乙醇中的RNA沉淀，2～8℃可以保存一周，-20℃条件下可以保存1年。RNA半衰期比较短，容易降解，建议提取后尽快进行后续实验，如反转录成cDNA，Northern Blot等。

6、若下游实验对DNA非常敏感，建议用不含RNase的DNase I对RNA进行处理。

操作步骤：

1、取200μl新鲜或者冻存的血清或血浆，加入3倍体积的游离RNA(血清血浆尿液)提取试剂。振荡30秒，充分混匀。

注意：样本加入游离RNA(血清血浆尿液)提取试剂后，可能会出现沉淀，经过振荡混匀后，沉淀基本消失。若仍有少量沉淀，不影响下游实验，可继续操作。

2、将处理后的样品在室温放置5分钟，使蛋白核酸复合物完全分离。

3、向以上溶液中加入氯仿，每使用1ml血清/血浆样本专用总RNA提取试剂加入0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置2-3分钟。

注意：如不能涡旋混匀，可手动快速颠倒混匀2分钟。

4、4℃ 12000rpm离心20分钟，此时样品分成三层：红色有机相，中间层和上层无色水相，RNA 主要在水相中，把水相转移到一个新的无RNase的离心管(自备)中。

5、在得到的水相溶液中加入等体积异丙醇，颠倒混匀，室温放置30分钟。或-20℃沉淀过夜，效果更佳。

6、4℃ 12000rpm 离心20分钟，弃上清。

注意：离心前RNA沉淀经常是看不见的，离心后在管侧和管底形成胶状沉淀。

7、加入75%乙醇(用无RNase的水配制)洗涤沉淀。每使用1ml游离RNA(血清血浆尿液)提取试剂加入1ml 75%乙醇对沉淀进行洗涤。

8、4℃ 12000rpm离心3分钟，小心吸弃上清，注意不要吸弃RNA沉淀。

注意：剩余的少量液体可短暂离心，然后用枪头吸出，注意不要吸弃沉淀。

9、室温放置2-3分钟，晾干。加入30-100μl无RNase的水，充分溶解RNA，得到的RNA保存在-70℃，防止降解。

注意：沉淀不要过分干燥，以免难于溶解。

储存条件：2～8℃。

实验步骤：

(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可！固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀

(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次

(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)

(7)10,000rpm,4℃离心20min

(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃离心20 min

(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC处理水溶解

(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量

(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)

操作步骤:

1. 匀浆处理:a.组织将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。

b.单层培养细胞直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。

c．细胞悬液离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。

2．将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。

3．可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。

6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。

7. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。

8. 2-8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

原创作者：上海莼试生物技术有限公司

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