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本试剂盒提供了一种快速、灵活的方法，适用于新鲜或冷冻全血(用柠檬酸盐、EDTA或肝素等抗凝剂处理过的样品)提取总DNA，包括基因组DNA和线粒体DNA。本品可以灵活处理0.1-20ml的全血，采用非离心柱的方法，无需使用苯酚、氯仿等有机溶剂，有效去除蛋白、色素、脂类及其它抑制性杂质污染。整个过程在一个管中操作，减少了污染及样本混淆的风险。提取的DNA产量高、质量好，可直接用于PCR、荧光定量PCR、酶切和Southern Blot以及文库构建等实验。

保存条件：Buffer FG1 2～8℃，其他组分室温(15～30℃)。

产品特点

1、纯度高：提取的基因组DNA可直接用于下游PCR、荧光定量PCR、酶切等各种实验。

2、提取量大：可从0.1-20ml的全血中提取DNA，无需使用苯酚、氯仿等有机溶剂。

3、兼容性强：适用于处理各种血液和细胞样本。

自备试剂：异丙醇、70%乙醇

实验前准备及重要注意事项：

1、向蛋白酶K 中加入指定用量(0.3ml/1.25ml)的蛋白酶K 储存液使其溶解，-20℃保存。配制好的蛋白酶K 勿长时间室温放置，避免反复冻融，以免影响其活性。

2、所有离心操作均在室温下完成。

3、血液样品反复冻融，会导致提取的DNA片段较小且提取量下降。所得基因组DNA也应尽可能避免反复冻融，以免降解。如果提取冷冻血液的基因组DNA，建议37℃水浴，迅速解冻后再进行后续操作。

4、血液样品的储存：

1)短期保存：已加入抗凝剂的血液样品可在2～8℃储存最多10天，对于某些实验例如Southern杂交等，需要得到完整全长的基因组DNA，请将血液样品在2～8℃储存不超过3天，此时基因组DNA的降解程度较轻。

2)长期保存：已加入抗凝剂的血液请置于-70℃保存(如果提取的是高分子量的DNA，推荐使用EDTA作为抗凝剂)。

操作步骤：

一、从100～900μl全血中提取基因组(以300μl血液处理量为例)

1、取300μl全血于2ml离心管(自备)中，加入300μl(样本等体积)Buffer FG1，上下颠倒混匀5次，10000×g离心30秒，弃上清。

2、再向离心管中加入450μl(1.5倍样本体积)Buffer FG1，涡旋震荡，使沉淀完全分散。10000g离心30秒，弃上清，并把离心管倒置于干净的吸水纸上，放置2分钟。

注意：在极少情况下沉淀可能会松弛，所以要缓慢倒掉上清。将离心管倒置在吸水纸上，可以减少管壁上清的回流。

3、按照附表配制Buffer FG2与蛋白酶K 的混合液(比例100:1)。

注意：此混合液最好现用现配.井在配好后1小时之内用完。

4、加入150μl的Buffer FG2与蛋白酶K 的混合液，立即涡旋混匀至溶液无团块。

注意：

1)如果有多个样品同时操作，加入Buffer FG2/蛋白酶K 混合液后立即涡旋震荡，不要等所有样品部加完后再震荡。

2)通常涡旋震荡3-4次.毎次5秒，可以使沉淀充分悬浮，如果涡旋震荡后发现沉淀中含胶状物质可以再加入30μl的Buffer FG2/蛋白酶K 混合液，再次混旋混匀。

5、65℃孵育10分钟，其间颠倒混匀数次。

注意：如果样品颜色从红色变成橄榄绿说明蛋白消化完全。

6、加入150μl导丙醇，上下颠倒彻底混匀直至出现丝状或簇状基因组DNA。

注意：与异丙醇完全混合对于沉淀DNA非常重要。如果样品中白细胞含量少，可能看不到DNA，则至少上下频倒高心管20次确保沉淀完全。

7、10000×g离心5分钟。

注意：如果沉淀贴壁不牢，可以适当延长离心时间或増大离心力。

8、弃上清，并把离心管倒置于干净的吸水纸上吸干。

注意：少数时候沉淀可能贴壁不牢，注意不要吸弃沉淀。

9、加入300μl的70%乙醇，涡旋震荡5秒，10000×g离心5分钟，弃上清。

注意：如果沉淀贴壁不牢，可以适当延长离心时间或増大离心力。

10、把离心管倒置于干净的吸水纸上5分钟，确保沉淀在管中。

注意：在管底可见白色的DNA沉淀，在极少情況下沉淀可能会松弛，所以要缓慢倒掉上清。

11、空气干燥DNA沉淀直至所有的液体挥发干净(至少5分钟)。

注意：乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、 PCR等)实验，但避免过度干操DNA沉淀，因过度干燥会使DNA难于溶解。

12、加入200lμl的Buffer GE，低速涡旋5秒，65℃孵育1小时溶解DNA，期间轻弹数次助溶。-20℃保存DNA。注意：如果DNA没有完全溶解，可室温过夜。如果使用少量的FG3溶解DNA，建议延长孵育时间。

实验步骤：

(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可！固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀

(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次

(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)

(7)10,000rpm,4℃离心20min

(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃离心20 min

(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC处理水溶解

(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量

(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)

操作步骤:

1. 匀浆处理:a.组织将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。

b.单层培养细胞直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。

c．细胞悬液离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。产品仅用于科研

2．将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。

3．可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。

6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。

7. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。

8. 2-8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

原创作者：上海莼试生物技术有限公司

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