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产品属性：

产品名称	英文名称	规格	货号
柱式细菌DNA提取试剂盒	Column Bacterial DNA Isolation Kit	50次	CS-01F99065

介绍

本产品是在在"百无忧"细菌DNA提取试剂盒基础上开发的柱式升级产品，可以用于绝大多数革氏阳性和阴性细菌基因组DNA的快速提取。

特点：

1. 操作简单，整个过程不到20分钟。

2. 产率一般在5-20μg/mL 过液培养的饱和菌液（10^8～10^9个细胞）。

3. OD260/280一般在1.8以上，可直接用于PCR、酶切、杂交等实验。

4. DNA片段长度一般在40-50 Kb左右。

5. 每次提取可以处理0.1-1.5mL的细菌，也可以使用菌落。

6. 价廉物美，与国外同类产品相比质量相当，但价格便宜。

7. 安全无毒，本试剂盒对人体无害，无腐蚀性和刺激性气味。

保存条件：常温(溶菌酶干粉需要4℃或-20℃保存)，有效期一年。

自备试剂：氯仿、自备无菌水

使用方法：

注意：溶液A和溶液B 容易产生沉淀，溶液B 十分粘稠，均需要放置在65℃预热使沉淀溶解、粘稠度降低，用前充分摇匀。

一、对革氏阴性细菌样品，不需用溶菌酶

1. 将0.1-1.5mL过夜培养的菌液转移到1.5mL塑料离心管中， 12,000rpm室温离心1分钟沉淀细菌，弃上清。

2. 加入300uL预热的溶液A 到细菌沉淀中，充分吹打均匀。

3. 再加入150uL预热的溶液B 到离心管中，颠倒数次混匀。此时溶液中可能有白色丝状悬浮物产生。由于溶液B 比较粘稠，可以采取称量方法取用，150μL约等于150-160 mg。也可以将1mL 枪头剪去一截再吸取。

4. 65℃放置3-5分钟。如果室温放置，DNA 产量会降低10-20%。

5. 加入200μl 自备氯仿，震荡混匀10-30 秒，此时溶液将呈乳白色。

6. 12,000rpm 室温离心2分钟。此时上清液将变得透明，中间层有白膜。小心转移上清液到一个新的1.5mL 塑料离心管中，避免触及中间层的白膜。

7. 加入1.5 倍体积(约0. 7mL)的溶液C，颠倒混匀后全部转移到离心吸附柱中，室温放置至少2分钟。

8. 12,000rpm 室温离心1分钟，DNA 将吸附在离心吸附柱的膜上，倒弃收集管中的穿透液。

9. 将0.5mL 通用洗柱液加入离心柱中，12,000rpm 室温离心1分钟，弃穿透液。

10. 重复上步操作一次。

11. 空甩半分钟去除残留液体,将离心吸附柱转移到新的1.5mL 离心管中。

12. 加50-100μl 通用洗脱液，室温放置3-5分钟。

13. 12,000rpm 室温离心1分钟即得DNA 溶液。

14. 由于本产品使用的离心吸附柱吸附DNA的能力较强，可以重复上步操作一次以便得到更多的DNA。
15. 直接取5-10μl 电泳检测DNA，其余放冰箱备用。

实验步骤：

(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可！固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀

(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次

(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)

(7)10,000rpm,4℃离心20min

(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃离心20 min

(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC处理水溶解

(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量

(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)

操作步骤:

1. 匀浆处理:a.组织将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。

b.单层培养细胞直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。

c．细胞悬液离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。产品仅用于科研

2．将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。

3．可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。

6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。

7. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。

8. 2-8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

原创作者：上海莼试生物技术有限公司

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柱式细菌DNA提取试剂盒