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本试剂盒采用可以特异性结合DNA的离心吸附柱和独特的缓冲液系统，能提取多种细胞/组织中的基因组DNA。离心吸附柱可以高效、专一吸附DNA，可最大限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物。提取的基因组DNA片段大，纯度高，质量稳定可靠。使用本试剂盒回收的DNA可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、文库构建、Southern杂交等实验。

操作步骤：

如非指出，所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。

1、处理材料：

a. 培养细胞：贴壁培养的细胞应先处理为细胞悬液(如用PBS缓冲液或类似缓冲液)，10,000 g离心1分钟，倒尽上清，加入200μl缓冲液GA，振荡至彻底悬浮。

b. 组织：取约30mg动物组织(脾组织用量应少于10 mg)加入到事先盛有200μl 缓冲液GA的1.5ml离心管中，用研磨杵彻底将组织研碎。

2、加入20μl蛋白酶K (20 mg/ml)溶液。

a. 提取细胞基因组时，加入蛋白酶K混匀后，55℃放置5-10分钟。

b. 提取组织基因组时，加入蛋白酶K混匀后，在55℃放置，直至组织溶解。

注：不同组织裂解时间不同，通常需1-3小时即可完成(鼠尾需要消化过夜),期间间歇颠倒混匀样品。

3、加入10μl RNaseA(10 mg/ml)溶液，混匀后室温放置2分钟。

4、加入220μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

注：加入缓冲液GB时可能会产生白色沉淀，一般70℃放置一段时间后会消失。如溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底，会影响DNA的纯度和得率，而且可能导致步骤6中离心柱堵塞。

5、加入220μl 无水乙醇，颠倒混匀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

注：加入乙醇后会产生絮状沉淀，可用枪头反复抽打1-2次将沉淀弄碎后再上柱。如果絮状物未做处理，容易导致步骤6中离心柱的堵塞。

6、将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CG中(吸附柱放入收集管中)，11000g离心2分钟，倒掉废液，吸附柱CG放回收集管中。

注：如果出现吸附柱堵塞现象，可将离心时间延长到5分钟。

7、向吸附柱CG中加入500μl去蛋白液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，11000g离心1分钟，倒掉废液，吸附柱CG放入收集管中。

8、向吸附柱CG中加入700μl 漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，11000g离心1分钟，倒掉废液，吸附柱CG放入收集管中。

9、向吸附柱CG中加入500μl 漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，11000g离心1分钟，倒掉废液。

10、将吸附柱CG放回废液收集管中，11000g离心2分钟。

注：此步骤非常重要，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验。

11、将吸附柱CG转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl经70℃水浴预热的洗脱缓冲液EB，室温放置2分钟，11000g离心2分钟。

注意：

a.洗脱缓冲液体积最好不少于100μl，体积过小影响回收效率。

b.洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率。

12、DNA产物-20℃保存。
储存条件：室温，有效期12个月。

实验步骤：

(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可！固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀

(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次

(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)

(7)10,000rpm,4℃离心20min

(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃离心20 min

(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC处理水溶解

(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量

(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)

操作步骤:

1. 匀浆处理:a.组织将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。

b.单层培养细胞直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。

c．细胞悬液离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。产品仅用于科研

2．将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。

3．可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。

6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。

7. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。

8. 2-8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

原创作者：上海莼试生物技术有限公司

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